qPCR 2x SYBR Master Mix

Popis produktu

qPCR 2x SYBR Master Mix je určený pro analýzu vzorků pomocí metody qPCR s kvantifikací amplifikovaných DNA fragmentů pomocí fluorescenčního DNA barviva SYBR Green I.

SYBR Green I

• Produkt obsahuje interkalační DNA barvivo SYBR Green I, které se po navázání na dvouvláknovou DNA stává silně fluorescenční s maximální excitací 497 nm (modré světlo) a emisí 520 nm (zelené světlo). Protože fluorescence SYBR Green I nenavázaného na DNA je velmi nízká, je nárůst fluorescence vzorku na konci elongační fáze PCR reakce přímo úměrný množství amplifikovaných fragmentů.

Rychlá příprava (2x koncentrovaný)

• Produkt obsahuje všechny konstantní komponenty pro qPCR 2x koncentrované (optimalizovaný reakční pufr, nukleotidy, Taq DNA polymerázu, protilátku anti-Taq, SYBR Green I). To umožňuje rychlou přípravu reakční směsi bez nutnosti rozmrazování a přesného dávkování jednotlivých komponent. Stačí dodat primery, templátovou DNA a eventuálně doplnit H₂O (součást balení).

Hot Start

• Produkt obsahuje monoklonální protilátku anti-Taq, která se váže na Taq DNA polymerázu a tím blokuje její enzymatickou aktivitu a zamezuje amplifikaci nespecifických DNA fragmentů. Protilátka je teplotně inaktivována při prvním denaturačním cyklu qPCR.

Citlivá detekce

• Tento produkt je optimalizován pro citlivou a přesnou detekci DNA fragmentů amplifikovaných při qPCR z genomové DNA nebo z cDNA, získané metodou reverzní transkripce.

Příklady využití

 

Obr. 1. Celková RNA z buněk Jurkat byla metodou reverzní transkripce převedena na cDNA s využitím RNA Blue RT-PCR kitu (kat. č. R001). Získaná cDNA byla buď neředěna nebo reděna 5x, 25x, 125x, 625x, 3125x a poté byly přidány primery specifické pro GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza) o výsledné koncentraci 1 µM. Získané vzorky byly smíchány 1:1 s qPCR 2x SYBR Master Mixem a analyzovány v hexaplikátech metodou qPCR na přístroji Roche LightCycler® 480 System. Grafy znázorňují intenzitu fluorescence v závislosti na cyklu PCR (A) a analýzu MTP ("melting point temperature") výsledných produktů pro každé ředění (B).

Obr. 2. qPCR 2x SYBR Master Mix umožňuje spolehlivou detekci různých genových produktů. Celková RNA z buněk Jurkat byla metodou reverzní transkripce převedena na cDNA s využitím RNA Blue RT-PCR kitu (kat. č. R001). Jako kontrola (ctrl) sloužil vzorek, ke kterému nebyla přidána reverzní transkriptáza. K získaným vzorkům byly dodány primery specifické pro GAPDH (glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza), TUBB (ß-tubulin), PGK1 (fosfoglycerát kináza 1), RPLPO (large ribosomal protein) nebo ACTB (ß-aktin) o výsledné koncentraci 1 µM. Následně byly vzorky smíchány 1:1 s qPCR 2x Master Mixema nalyzovány v triplikátech metodou qPCR na přístroji Roche LightCycler® 480 System. Graf znázorňuje intenzitu fluorescencev závislosti na cyklu PCR pro jednotlivé páry primerů.

Technické údaje

Komponenty základního balení

• 1 zkumavka s 0,5 ml qPCR 2x SYBR Master Mixu (na 40 reakcí po 25 µl).
• 1 zkumavka 1,5 ml PCR H₂O.

Skladování

• Skladovat při teplotě -20°C ± 5°C. Materiál snáší opakované rozmrazování.

Složení 

• Dodává se 2x koncentrovaný: 20 mM Tris-HCl, pH 8,8 (25°C), 100mM KCl, 0,2% Triton X-100, 3 mM MgCl₂, 400 µM dATP, 400 µM dCTP, 400 µM dGTP, 400 µM dTTP, Taq DNA polymeráza (50 U/ml), monoklonální protilátka anti-Taq, SYBR Green I, stabilizátory a aditiva.

Kontrola kvality  

• Každá šarže qPCR 2x SYBR Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA.