1. Domů
  2. DNA polymerázy a pufry

DNA polymerázy a pufry

Úvod

Polymerázová řetězcová reakce (PCR) představuje jednu ze základních molekulárně-genetických technik. Během této reakce dochází k mnohonásobné amplifikaci specifického úseku templátové DNA, který je vymezen dvěma oligonukleotidovými primery.

PCR je tvořena několika dílčími kroky, které probíhají za různé teploty. Prvním z nich je denaturace templátové DNA (při 94°C), poté následuje nasednutí primerů (v rozmezí 50-68°C, v závislosti na sekvenci primerů) a posledním je syntéza komplementárního vlákna DNA ve směru 5´→3´ (při 72°C). Tyto tři kroky se opakují v mnoha cyklech (obvykle 20-40), kdy v každém z nich dochází v optimálním případě ke zdvojnásobení množství amplifikovaného DNA fragmentu.

Reakční směs pro PCR obsahuje následující základní komponenty: teplotně rezistentní DNA polymerázu, reakční pufr obsahující Mg2+, směs deoxyribonukleotid trifosfátů (dNTP), templátovou DNA a pár oligonukleotidových primerů. Firma Top-Bio nabízí sedm produktů obsahujících koncentráty teplotně resistentních DNA polymeráz určených pro PCR. Tyto produkty se liší v koncentraci a vlastnostech enzymů, složení skladovacích a reakčních pufrů, přítomností aditiv a množstvím kontaminující DNA.

Q-Taq DNA polymeráza

  • Obsahuje rekombinantní Taq DNA polymerázu (5U/ul) v optimalizovaném skladovacím pufru, který zvyšuje stabilitu enzymu a zajišťuje robustnější průběh PCR. Enzym je izolovaný nově vyvinutou metodou, která snižuje množství kontaminující DNA na nedetekovatelnou úroveň, zatímco v komerčně dostupných a námi testovaných preparátech DNA polymeráz je hladina kontaminující DNA 20 – 40 ng/ml. Je zvláště vhodný pro určování kontaminace vzorků bakteriemi a pro mikrobiální genotypizace.

Taq DNA polymeráza

  • Standardní produkt obsahuje Taq DNA polymerázu v koncentraci 5U/μl v běžném skladovacím pufru a je určený pro rutinní aplikace diagnostického charakteru. 

Taq DNA polymeráza Unis

  • Obsahuje Taq DNA polymerázu (5U/μl) v optimalizovaném skladovacím pufru, který zvyšuje stabilitu enzymu a zajišťuje robustnější průběh PCR. 

Taq-Purple DNA polymeráza

  • Obsahuje Taq DNA polymerázu Unis o nižší koncentraci enzymu (1 U/μl) a navíc obsahuje inertní barvivo, které usnadňuje dávkování a vizuální kontrolu přítomnosti enzymu. 

Taq DNA polymeráza 1.1

  • Obsahuje Taq DNA polymerázu o nižší koncentraci enzymu (1 U/μl). Enzym je dodáván s upraveným reakčním pufrem (Blue buffer), který snižuje nároky na optimalizaci koncentrace Mg2+ a snižuje tvorbu nespecifických produktů. 

Combi Taq DNA polymeráza

  • Obsahuje Taq DNA polymerázu o nižší koncentraci enzymu (1 U/μl). Navíc obsahuje monoklonální protilátku proti Taq DNA polymeráze a tím umožňuje tzv. „hot start“ PCR, ve které je aktivita enzymu blokována protilátkou až do prvního denaturačního kroku. Při denaturační teplotě (94oC) dochází k irreverzibilní denaturaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity polymerázy. Tímto způsobem výrazně klesá tvorba nespecifických DNA fragmentů v důsledků aktivity polymerázy před prvním cyklem PCR. 

LA DNA polymerases Mix

  • Obsahuje směs dvou polymeráz. Taq DNA polymeráza umožňuje rychlou  a robustní syntézu DNA, zatímco druhá polymeráza s 3´→5´ exonukleázovou aktivitou snižuje množství chyb, které vznikají při amplifikaci Taq DNA polymerázou. LA DNA polymerases Mix je vhodný především pro amplifikaci dlouhých fragmentů DNA (až do velikosti 40 kbp) a také amplifikaci DNA fragmentů, které jsou určeny pro klonování (s přibližně 5x nižším výskytem mutací ve srovnání s Taq DNA polymerázou).
Seřadit zboží
10x konc. PCR Blue Buffer bez MgCl2+MgCl2
Jedná se o reakční pufr pro PCR, jehož základem je síran amonný. Blue Buffer umožňuje optimální průběh PCR v širším rozmezí koncentrací hořčíku než klasický reakční pufr s KCl. Při použití  tohoto pufru bývá snížena tvorba nespecifických PCR produktů.
LA DNA Polymerases Mix
LA DNA Polymerases Mix představuje unikátní směs dvou DNA polymeráz. Jednou  z nich je Taq DNA polymeráza, která je vysoce procesivní, ale postrádá 3´→5´ exonukleázovou aktivitu a tedy není schopna opravovat chyby v podobě nukleotidových záměn při syntéze komplementárního řetězce DNA. Druhá polymeráza je sice méně rychlá v syntéze nukleotidů, ale má schopnost 3´→5´ exonukleázové aktivity a výrazně tak snižuje množství chyb vzniklých při replikaci DNA.
Taq DNA polymeráza 1.1
Tento produkt je modifikací Taq DNA polymerázy Unis (katalogové číslo T037-T039). Rozdílem je nižší koncentrace polymerázy (1 U/µl), což umožňuje přesnější dávkování enzymu. Produkt je dále dodáván s 10x koncentrovaným reakčním pufrem nazvaným „PCR Blue Buffer“. Tento pufr obsahuje síran amonný, který umožňuje optimální průběh PCR v širším rozmezí koncentrací hořčíku než klasický 10x reakční pufr a navíc snižuje tvorbu nespecifických DNA fragmentů.
Taq DNA polymeráza
Taq DNA polymeráza je termostabilní enzym pocházející z bakterie Thermus aquaticus. Tento enzym katalyzuje syntézu komplementárního řetězce DNA ve směru 5´→3´ a také vykazuje exonukleázovou aktivitu ve směru 5´→3´. Při amplifikaci DNA fragmentů Taq polymeráza často přidává na 3´ konec přesahující adenosin, který lze využít pro tzv. TA klonaci PCR produktů. Tato polymeráza však nemá exonukleázovou aktivitu ve směru 3´→5´ a v důsledku toho není schopna opravovat chyby vzniklé při amplifikaci.
Taq DNA polymeráza Unis
Taq DNA polymeráza Unis představuje alternativu k Taq DNA polymeráze (katalogové číslo T032-T034). Rozdíl mezi těmito produkty spočívá v použití jiného  skladovacího pufru, který zajišťuje vyšší stabilitu enzymu a zvyšuje enzymatickou účinnost. Případné amplifikaci nespecifických fragmentů lze obvykle zamezit větším ředěním enzymu.
Taq-Purple DNA polymeráza
Tento produkt je modifikací produktu Taq DNA polymerázy Unis (kat. č. T037-T039). Rozdílem je nižší koncentrace polymerázy (1 U/µl), což umožňuje přesnější dávkování enzymu, a přídavek inertního barviva, které umožňuje vizuální kontrolu přítomnosti enzymu  v reakční směsi.
Q-Taq DNA polymeráza
Jedná se o rekombinantní DNA polymerázu, izolovanou nově vyvinutou metodou snižující množství kontaminující DNA. V komerčně dostupných preparátech DNA polymeráz je přítomno 10 - 1000 genomových ekvivalentů bakteriální dsDNA na jednotku enzymu (Spangler et al., Plos One, 4: e7010, 2009). Bakteriální DNA, kontaminující preparáty DNA polymeráz, může způsobovat problémy při některých typech DNA amplifikací, zvláště bakteriálních genotypizací pomocí PCR. Q-Taq DNA polymeráza má významným způsobem sníženou kontaminující dsDNA (viz Tabulka 1) a zvyšuje kvalitu PCR s některými typy primerů (viz Obrázek 1).