Combi Taq DNA polymeráza

Popis produktu

Combi Taq DNA polymeráza je modifikací produktu Taq DNA polymerázy Unis (kat. č. T037-T039), od které se liší přídavkem monoklonální protilátky anti-Taq, která umožňuje „hot-start“ blokující předčasnou aktivaci DNA polymerázy, což přispívá k vysoké specificitě reakce. Dalším rozdílem je nižší koncentrace polymerázy (1 U/µl), což umožňuje přesnější dávkování enzymu.

Hot Start

Tento produkt obsahuje monoklonální protilátku, která se specificky váže na Taq DNA polymerázu a tím blokuje její enzymatickou aktivitu až do prvního denaturačního kroku. Při teplotě 94^oC dochází k irreverzibilní denaturaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity DNA polymerázy. Tímto způsobem výrazně klesá tvorba nespecifických DNA fragmentů v důsledku aktivity polymerázy před prvním cyklem PCR.

Taq DNA polymeráza

• Taq DNA polymeráza je termostabilní enzym pocházející z bakterie Thermus aquaticus. Tento enzym katalyzuje syntézu komplementárního řetězce DNA ve směru 5´→3´ a také vykazuje exonukleázovou aktivitu ve směru 5´→3´. Při amplifikaci DNA fragmentů Taq polymeráza často přidává na 3´ konec přesahující adenosin, který lze využít pro tzv. TA klonaci PCR produktů. Tato polymeráza však nemá exonukleázovou aktivitu ve směru 3´→5´ a v důsledku toho není schopna opravovat chyby vzniklé při amplifikaci. Výhodou tohoto enzymu je jeho vysoká aktivita (amplifikace 1000 párů bází (bp) trvá < 1 minutu); nevýhodou je výskyt chyb při replikaci (přibližně 1 chyba na 10⁵ až 10⁶ syntetizovaných párů bází). Hlavní využití Taq DNA polymerázy je v diagnostické analýze přítomnosti specifických fragmentů DNA pomocí PCR až do velikosti kolem 5000 bp.

Technické údaje

Komponenty a balení

• Combi Taq DNA polymeráza je dodávána v koncentraci 1 U/µl. V základním balení jsou: 1 zkumavka s 500 U/500 µl (C205), 5 zkumavek po 500 U/500 µl (C206) nebo 10 zkumavek po 500 U/500 µl (C207).

• Ke každé zkumavce s Combi Taq DNA polymerázou je přidána 1 zkumavka (1,5 ml) s 10x reakčním pufrem (zelené víčko kat. č. T029) a jedna zkumavka (1,5 ml) s 10x PCR Blue Bufferem, který vykazuje vyšší toleranci k suboptimálním koncentracím Mg²⁺ (modré víčko kat. č. T058).

Pro optimalizaci koncentrace MgCl₂ lze objednat 10x konc. reakční pufr bez MgCl₂, ke kterému je dodáván 25 mM MgCl₂ v samostatné zkumavce (kat. č. T035), nebo 10x konc. PCR Blue Buffer bez MgCl₂ s 25 mM MgCl₂ v samostatné zkumavce (kat. č. T059).

Skladování

• Skladovat při teplotě -20°C ± 5°C. Krátkodobě (dny) lze skladovat/přepravovat při teplotě až do 30^oC.

Složení

• Skladovací pufr pro Combi Taq DNA polymerázu: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (25°C), 100 mM KCl, 0,02 mM EDTA, 0,2 mM DTT, 0,1% Nonidet P-40, 0,1% Tween 20, 50% glycerol.

• 10x reakční pufr: 100 mM Tris-HCl, pH 8,8 (25°C), 500 mM KCl, 1% Triton X-100, 15 mM MgCl₂.

• 10x konc. PCR Blue Buffer (modré víčko): 750 mM Tris-HCl, pH 8,8 (25°C), 200 mM (NH₄)₂SO₄, 1% Tween 20, 25 mM MgCl₂.

Aktivita

• Jedna jednotka aktivity (U) je definována jako množství enzymu, které katalyzuje zabudování 10 nmol dNTP během 30 min při 72°C do materiálu precipitovatelného trichloroctovou kyselinou. Reakce probíhá v objemu 50 µl v pufru obsahujícím 10 mM Tris-HCl (pH 8,8 při 25°C), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, 200 µM dATP, dCTP, dGTP a [α-³²P]dTTP, 50 µg/ml denaturované DNA, 0,5 µM primer a 0,2 - 0,5 U enzymu.

Kontrola kvality

• Čistota Combi Taq DNA polymerázy je ověřována metodou SDS PAGE. Enzym migruje jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kD. Preparát neobsahuje nukleázy.

• Každá výrobní šarže Combi Taq DNA polymerázy je testována na schopnost amplifikovat fragment genu savčí genomové DNA pomocí PCR. Výsledný produkt je analyzován elektroforézou na agarózovém gelu v přítomnosti ethidium bromidu; pouze očekávaný fragment DNA je produkován.