Hot Start DNA polymerázy

Úvod

Hot Start DNA polymerázy jsou enzymy, které mají reverzibilně blokovanou enzymatickou aktivitu. V prvním cyklu PCR dochází k odblokování této aktivity. Tím je zajištěno, že při přípravě PCR směsí nedojde k amplifikaci úseků s primery nespecificky vázanými na DNA. Při Hot Start PCR enzym získá aktivitu až při vyšší teplotě při které je nespecifické nasedání primerů zanedbatelné. Pro efektivní Hot Start PCR se často využívají monoklonální protilátky, které se vážou do katalytického místa enzymu. Při prvním denaturačním cyklu PCR (94^oC) dojde k ireverzibilní teplotní denaturaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity. V produktech Top-Bio provenience je využívána monoklonální protilátka anti-Taq, která je vhodná pro hot-start PCR (Nucleic Acids Res., 36: e93, 2008). Obdobnou funkci jako protilátky mohou mít DNA aptamery, které jsou izolovány z oligonukleotidových knihoven. V rámci spolupráce mezi Top-Bio a Ústavem molekulární genetiky AVČR byl získán aptamer anti-Taq, který je nově využíván pro hot start PCR.

Ve srovnání s protilátkou má DNA aptamer anti-Taq několik výhod při použití pro Hot Start PCR:
(1) nedochází u něj k ireverzibilní denaturaci při teplotách až do 100^oC,
(2) jedná se o nízkomolekulární látku, která je připravována synteticky a má známé a definované složení,
(3) není kontaminován komponentami savčích buněk,
(4) je odolný k působení proteáz,
(5) umožňují přípravu PCR směsí při pokojové teplotě,
(6) je cenově dostupnější.

V současné době firma Top-Bio vyrábí a dodává tyto Hot Start polymerázy:  

Combi Taq DNA polymeráza

• Obsahuje Taq DNA polymerázu o nižší koncentraci enzymu (1 U/μl). Navíc obsahuje monoklonální protilátku proti Taq DNA polymeráze a tím umožňuje tzv. „hot start“ PCR, ve které je aktivita enzymu blokována protilátkou až do prvního denaturačního kroku. Při denaturační teplotě (94^oC) dochází k irreverzibilní denaturaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity polymerázy. Tímto způsobem výrazně klesá tvorba nespecifických DNA fragmentů v důsledků aktivity polymerázy před prvním cyklem PCR. 

Aptamer-Taq DNA polymeráza  

• Obsahuje Taq DNA polymerázu o nižší koncentraci enzymu (1 U/μl). Obsahuje DNA aptamer anti-Taq. Tento aptamer, stejně jako protilátka inhibuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy. Ve srovnání s protilátkou má aptamer anti-Taq několik výhod při použití pro „hot-start“ PCR: (1) nedochází u něj k irreverzibilní denaturaci při teplotách až do 100^oC, (2) jedná se o nízkomolekulární látku, která je připravována synteticky a má známé a definované složení, (3) není kontaminován komponentami savčích buněk, (4) je odolný k působení proteáz a umožňují přípravu PCR směsí při pokojové teplotě, (5) Je cenově dostupnější. 

Aptamer-Taq DNA polymeráza, 5 U/µl  

• Obsahuje Taq DNA polymerázu o koncentraci enzymu (5 U/μl).
• Dále obsahuje DNA aptamer anti-Taq. Tento aptamer, stejně jako protilátka inhibuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy.
• Tento produkt je vhodný pro přípravu PCR reakčních směsí, kdy objemy Taq DNA polymerázy jsou omezující.