Real-time PCR (qPCR) Master Mixy

Úvod

Kvantitativní PCR (qPCR; z anglického „quantitative PCR“), nazývaná také „real-time“ PCR, je metoda vhodná pro stanovení relativního množství specifické DNA v reakční směsi. V kombinaci s metodou reverzní transkripce, umožňující přepis RNA na cDNA, se jedná o základní nástroj pro studium genové exprese konkrétních genů v buňkách.

Předpokladem qPCR analýzy je  dostupnost termálních cyklerů, které jsou vybaveny zařízením pro monitorování fluorescence v jednotlivých cyklech qPCR. Dalším požadavkem je dostupnost reakčních směsí vhodných pro amplifikaci DNA fragmentů v přítomnosti fluorescenčního DNA barviva nebo sondy, které umožňují kvantifikaci DNA. Firma Top-Bio nabízí několik optimalizovaných reakčních směsí, označovaných Master Mixy, které jsou určené pro amplifikaci DNA fragmentů metodou qPCR.

Důležitou komponentou Master Mixů je monoklonální protilátka anti-Taq, která inaktivuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy. V prvním cyklu PCR, po dosažení temploty 94^oC, dochází k irreverzibilní denaturací anti-Taq protilátky a odblokování jejího inhibičního efektu. Tím způsobem ("hot start") je výrazně snížena tvorba nespecifických produktů. Master Mixy obsahují všechny komponenty 2x koncentrované (pufr, nukleotidy, enzym, protilátka) a před vlastní qPCR stačí přidat DNA templát, primery, H₂O a případně fluorescenční sondu. Master Mixy Top-Bio provenience mají různé využití.

qPCR Master Mixy s fluorescenčním DNA barvivem:

qPCR 2x SYBR Master Mix

• Základní produkt obsahující fluorescenční DNA barvivo SYBR Green I, které se interkaluje mezi báze dvouvláknové DNA. Je vhodný pro většinu amplifikací detekující relativní množství studované DNA bez požadavku na specifické sondy.

qPCR 2x SYBR Master Mix_Blue

• Jedná se o qPCR 2x SYBR Master Mix, obohacený o barvivo qPCR Visible Blue Mark. Barvivo neovlivňuje průběh PCR, ale usnadňuje vizualizaci přítomnosti Master mixů ve více-jamkových destičkách.

qPCR 2x SYTO-9 Master Mix

• Tento produkt obsahuje fluorescenční DNA barvivo SYTO-9, které umožňuje amplifikaci delších fragmentů DNA (až do velikosti 1kbp) a je vhodné pro HRM („high resolution melting“) analýzu amplifikovaných úseků DNA.

TP SYBR 2x Master Mix

•  Je určený pro univerzální analýzu vzorků pomocí metody qPCR s kvantifikací amplifikovaných DNA fragmentů pomocí fluorescenčního DNA barviva SYBR Green I. Vychází z nedávného nálezu, že přidání Trehalózy a 1,2-Propandiolu (zkráceně TP) do reakční směsi může podstatně zvýšit účinnost PCR a napomoci při amplifikaci obtížně analyzovatelných vzorků, včetně DNA z neseparované krve, se zvýšeným obsahem GC a vzorků, které obsahují inhibitory PCR (Horáková a spol., BMC Biotechnology, 11:41, 2011; Free PMC article).

qPCR Master Mixy:

qPCR 2x Blue Master Mix

• Tento produkt stejně jako qPCR 2x Master Mix neobsahuje fluorescenční barvivo a je proto vhodný pro detekci PCR produktů pomocí specifických sond. Rozdílné složení reakčního pufru obsahující síran amonný může být účinnější pro průběh některých qPCR.

qPCR 2x Blue Master Mix_BLUE

• Jedná se o qPCR 2x Blue Master Mix, obohacený o barvivo qPCR Visible Blue Mark. Barvivo neovlivňuje průběh PCR, ale usnadňuje vizualizaci přítomnosti Master mixů ve více-jamkových destičkách.

qPCR 2x Master Mix

• Tento produkt je svým složením shodný s qPCR 2x SYBR Master Mix, avšak neobsahuje fluorescenční barvivo. Proto je vhodný na metody využívající alternativní způsoby detekce amplifikovaných fragmentů DNA, jako například detekční sondy typu TaqMan, Molecular beacons, Fret a další.

La Hot Start Plain Master Mix

• Obsahuje unikátní směs dvou DNA polymeráz Kombinace těchto dvou polymeráz vede k výraznému snížení chyb při zachování vysoké robustnosti (LA = Long and Accurate PCR).
  

Ostatní

qPCR Visible Blue Mark

• Jedná se o 200x koncentrované modré barvivo, které zvyšuje viditelnost reakčních směsí a přitom neovlivňuje účinnost PCR a neinterferuje s široce používanými fluorescenčními DNA barvivy (např. SYBR Green) a sondami využívanými pro qPCR.